Спартак Мишулин родился в Москве 22 октября 1926 года. Его мать, Анна Мишулина, занимала пост заместителя наркома промышленности, а отца актёр не знал. В юности Мишулин мечтал о сцене и участвовал в самодеятельности. За кражу книги его приговорили к 1,5 года заключения; после попытки передать другим заключённым зерно срок увеличили ещё на 1,5 года. Получив тяжёлую травму под трактором, он был комиссован из колонии.

После работы в провинциальных театрах Мишулин в 1960 году выбрал Театр сатиры, которому посвятил 45 лет. Широкую известность ему принесли роль пана Директора в телепередаче «Кабачок „13 стульев“» и образ Саида в фильме «Белое солнце пустыни». В спектакле «Малыш и Карлсон, который живёт на крыше» он выступил режиссёром и сыграл главную роль. Постановку показали более 2 тыс. раз.

Мишулин умер 17 июля 2005 года в возрасте 78 лет после операции на сердце. В 1979 году у него родилась дочь Карина. В 2017 году Тимур Еремеев заявил, что является сыном актёра; отцовство, согласно материалу, подтвердил тест ДНК.